4-(4-dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium and Parkinsonian-Disorders

To carry out a functional analysis of dopamine transporter (DAT) in autosomal recessive Parkinson's disease caused by mutations in the PARK2 gene.. Cultures of dopaminergic neurons were obtained from fibroblasts of a patient with PARK2 form of Parkinson's disease and a healthy donor with the use of the cell reprogramming technology. DAT expression in both cell cultures was assessed at the RNA and protein levels, and DAT activity was tested with the use of the fluorescent dopamine analogue ASP+.. In the cells with PARK2 mutations, the level of DAT expression was significantly higher than in normal neurons, but the intensity of ASP+ capture by mutant dopaminergic neurons was 25% down from normal neurons. For the study of competitive inhibition of DAT, dopamine was added to the incubation medium containing ASP+: it was shown that dopamine binding by the normal cells was almost twice as much relative to PARK2 mutant neurons. Therefore, dopaminergic neurons carrying mutations in the PARK2 gene are characterized by functional failure of dopamine transport systems. One of cell mechanisms of compensation of this defect seems to be an early increase of expression of the DAT transporter protein.. Цель исследования - функциональный анализ дофаминового транспортера (DAT) при аутосомно-рецессивной болезни Паркинсона (БП), обусловленной мутациями в гене PARK2. Материал и методы. Культуры дофаминергических нейронов получены из фибробластов пациента с PARK2-формой БП и от здорового донора с помощью технологии клеточного репрограммирования. Экспрессия DAT в обеих клеточных линиях оценивалась на уровне мРНК и белка, а его активность - с помощью флуоресцентного аналога дофамина ASP+. Результаты и заключение. В клетках с мутациями PARK2 уровень экспрессии DAT был достоверно выше по сравнению с нормальными нейронами, однако интенсивность захвата ASP+ мутантными дофаминергическими нейронами оказалась на 25% ниже по сравнению с нормой. Для исследования конкурентного ингибирования DAT в среду инкубации совместно с ASP+ был добавлен дофамин: в результате установлено, что связывание дофамина нормальными клетками почти вдвое выше, чем PARK2-мутантными нейронами. Таким образом, дофаминергические нейроны, несущие мутации в гене PARK2, характеризуются функциональной недостаточностью систем дофаминового транспорта. Одним из клеточных механизмов компенсации этого дефекта является, по-видимому, раннее повышение экспрессии белка DAT транспортера.

Topics: Cells, Cultured; Cellular Reprogramming Techniques; Dopamine; Dopamine Plasma Membrane Transport Proteins; Dopaminergic Neurons; Fibroblasts; Fluorescent Dyes; Humans; Mutation; Parkinsonian Disorders; Pyridinium Compounds; Ubiquitin-Protein Ligases